本试剂盒适用于克隆带有3’末端A突出的的PCR产物。本试剂盒提供的独特连接系统允许用户在1～2小时内的时间里完成连接反应。
本公司的pUCm-T载体是为简化PCR产物的克隆而设计的。许多热稳定的DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等扩增的PCR产物在3’末端后都带有一个突出的碱基A，这样的PCR产物很容易连接到带有突出碱基T的T载体上。
pUCm-T载体是一种新颖的pUC系列T载体，其多克隆位点大多是单切点，以及β-半乳糖苷酶读码框的调整，大大方便了克隆的蓝/白筛选。插入位点两端独特设计的两个PstI位点使插入片段可以用Pst I单酶切进行检测，也可以用非常廉价而高效的EcoR I和Hind III双酶切进行检测。可以用M13通用引物和T7启动子引物对PCR产物进行测序。pUCm-T含有T7 RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录。
本说明书末列出了pUCm-T相关的技术资料，其全序列可参照pUC19(GenBank Accession Number M77789)，只是其多克隆位点部分的序列有所不同。
| 组分 | 20T | 100T |
| pUCm-T vector | 1μg | 5μg |
| 10×Ligation Buffer | 50μL | 200μL |
| 50% PEG4000 | 50μL | 200μL |
| T4 DNA Ligase(5U/μL) | 100U | 500U |
| Sterilized ddH2O | 1mL | 1mL |
保存：-20℃
- 连接反应的准备：
PCR产物是否需要纯化取决于扩增产物的质量。如果PCR产物特异性很高，则不需要对产物进行纯化。但是如果将质粒作为模板，则需要对PCR产物进行纯化，因为质粒模板在转化后会形成白色的菌落。PCR产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。本公司的PCR产物胶回收试剂盒(B610353)可有效回收>60bp的DNA片段。
Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物会在3’末端添加碱基A。Taq DNA聚合酶同具有3'→5'外切酶活性的Pfu、Pwo、Tli或Deep vent DNA聚合酶共同扩增的产物也可能会在3’末端添加碱基A。PCR产物3’端含有突出的碱基A可以被连接到pUCm-T上。具有3’?5’外切酶活性的DNA聚合酶扩增的PCR产物为平末端，克隆这样的片段需要在平末端加A。
- 连接反应：
- 在一个标准的10μL连接反应体系中，加入50ng (1μL) pUCm-T vector、0.2pmol PCR产物、1μL 10×ligation Buffer和1μL T4 DNA Ligase，并加入ddH2O至终体积为10μL，通常不需要对PCR产物进行定量。连接反应体系可根据如下进行配制：
注：T4 DNA Ligase最后加。成分 用量 10×Ligation Buffer 1μL 50%PEG 1μL pUCm-T vector 1μL 纯化的PCR产物 X μl Sterilized water Y μl T4 DNA Ligase 1μL 总体积 10μL - 16～23℃连接1h～过夜。
注：常规实验1h已足够。
- 在一个标准的10μL连接反应体系中，加入50ng (1μL) pUCm-T vector、0.2pmol PCR产物、1μL 10×ligation Buffer和1μL T4 DNA Ligase，并加入ddH2O至终体积为10μL，通常不需要对PCR产物进行定量。连接反应体系可根据如下进行配制：
- 转化：
- 将100μL感受态细胞冰上解冻，完全溶解后轻轻混匀。
- 加入5μL上述连接液，轻轻混匀，冰上放置30min。
- 42℃水浴热激1.5min。再在冰上放置2～10min。
- 加入400μL LB培养基，37℃ 200～250rpm振荡培养1h。
- 4000rpm离心5min，用枪头吸掉400μL上清液，用剩余的培养基将细胞重悬。
- 将细菌悬液均匀涂布在含有20μL IPTG(100mM)和100μL X-gal(20mg/mL)的氨苄青霉素抗性的LB平板上。
注：使用细菌的数量取决于连接和转化的效率。 - 将平板在37℃正向放置1小时后吸掉过多的液体，倒置培养过夜。
- 将100μL感受态细胞冰上解冻，完全溶解后轻轻混匀。
- 筛选
通过蓝/白斑筛选转化子
当外来DNA片段被克隆进pUCm-T时，LacZ基因读码框的编码序列被插入的外来DNA改变，因此a-序列的活性被影响，重组克隆可在X-gal/IPTG平板上通过颜色进行筛选，未发生重组克隆的菌落为蓝色。用牙签挑选IPTG/X-gal平板上的白色菌落，转移到含Amp+的液体培养基37℃过夜培养。 - 转化子的鉴定
- 从含白色菌落的液体培养基中提取质粒，用PstI或其它合适的限制性内切酶酶切质粒，检测插入片段的大小，以证明该菌落是否含有目的片段。
- 克隆的目的片段可使用M13通用引物或其它合适的引物进行测序，进一步证明该菌落含有目的片段。
- 从含白色菌落的液体培养基中提取质粒，用PstI或其它合适的限制性内切酶酶切质粒，检测插入片段的大小，以证明该菌落是否含有目的片段。
- pUCm-T载体图谱
- UCm-T载体启动子和多克隆位点序列
- pUCm-T载体的酶切位点
- 不切割pUCm-T载体的限制性内切酶
AcaI AccIII AceII Afa24RI AgeI AmaI AosIII ApaI ApeI AscI Asp78I AtuCI AvaIII AvrII BaeI BalI Bbf7411I BbsI BclI Bco102II BfrBI BlpI BmgI BplI Bpu10I Bpu1268I BsaAI BsaFI BsaKI BsaMI BscEI BscJI Bse59I BseRI BsgI BsiWI BsmFI BsmGI Bsp120I Bsp87I BspGI BspLU11III BsrGI BssHII Bst1107I Bst29I Bst98I BstEII BstXI Bsu36I CfrAI CspI Csp45I DraIII DrdII EciAI EciEI Eco47III Eco72I EcoAI EcoBI EcoDI EcoDXXI EcoDR3 EcoEI EcoNI EcoR124I EcoR124II EcoRD3 FinI FseI HpaI MluI Mlu1106I Mlu113I Msp20I MunI NaeI NgoMI NheI NruI NsiI PacI PauI PfuI PmeI Ppu10I Ppu6I PpuMI PshAI RleAI SacII SanDI SfiI SgfI SgrAI SmaI SnaI SnaBI SpeI SrfI Sse8647I StuI StySQ SwaI Uba1220I Uba1221I Uba1382I UbaDI Van91I XmaI - 切割pUCm-T载体一次的限制性内切酶
AacI 497 AteI 455 BsbI 117 Eco52I 463 KasI 235 SphI 532 AatII 2708 AvaI 504 BshLI 449 Eco82I 395 KpnI 412 Sse8387I 526 AccI 517 BamHI 498 BsoDI 462 EcoDR2 397 NarI 236 SspI 2590 Acc65I 408 BanII 406 Bsp117I 401 EcoICRI 404 NcoI 456 StyI 456 AcrI 503 BbeI 239 BspJ106I 407 EcoKI 2443 Nli387/7I 508 StySJ 158 Acs1371I 515 BbeAI 234 BspLU11I 893 EcoO109I 2762 NotI 463 StySPI 2443 AflIII 893 BbrI 534 BspMI 529 EcoRI 396 Pfl1108I 1801 SynII 2380 AflIV 2263 BcgI 2291 Bst224I 455 EcoRV 452 Ppu1253I 2703 Tth111I 478 AhyAI 503 BcgI 2325 Cfr10I 1866 EcoprrI 541 PssI 2765 Tth111II 1490 AlwNI 1309 Bco63I 492 ChuII 515 EheI 237 SacI 406 Uba1326 2760 ApaBI 186 BglII 492 ClaI 445 Esp16I 50 SalI 516 XbaI 510 ApoI 396 Bli49I 1852 DsaI 456 Esp3I 45 SapI 777 XcmI 484 Apu16I 443 BsaI 1847 DsaVI 515 FsuI 474 ScaI 2266 XhoI 504 Asp52I 533 BsaXI 756 Ecl137I 401 HincII 518 SciI 506 XmnI 2385 Asp5HI 527 BsaBI 497 EclHKI 1786 HindIII 534 SexAI 476
- 不切割pUCm-T载体的限制性内切酶
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